Mikrobiologisches Praktikum

- Sterilisationsmethoden -



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Versuchsziel:

In diesem Versuch sollen 250 ml des Komplexnährmediums HPG angesetzt und als Agarplatten ausgegossen werden, dabei soll das Sterilisationsverfahren des Autoklavierens erprobt und auf seine Wirksamkeit hin überprüft werden.

Theoretische Grundlagen:

Mikroorganismen bedürfen zu Ihrer Kultivierung und Anzucht mehr oder weniger spezifischer Nährmedien oder -lösungen, die ihren Stoffwechsel bzw. Energiehaushalt mit den erforderlichen Nährstoffen und Spurenelementen versorgen. Dabei bedient man sich sogenannter Komplexmedien, wenn einerseits gute Wachstumsbedingungen geschaffen werden sollen und andererseits ein unspezifisches Nährmedium bereitgestellt werden soll, so dass einem möglichst breiten Spektrum von Mikroorganismen (insbesondere auch auxtrophen Organismen, also jenen, die auf essentielle organische Verbindungen (Wachstumsfaktoren) im Nährmedium angewiesen sind), gute Wachstumsbedingungen geboten werden kann und von dem zusätzlich in der Herstellung nicht eine präzise definierte Zusammensetzung verlangt wird. Ferner haben Komplexmedien Pufferwirkung, so dass ohne grösseren Aufwand ein für Mikroorganismen optimaler pH-Wert von 6-8 gewährleistet wird. Komplexmedien lassen sich flüssig oder fest darstellen; das in diesem Versuch hergestellte Medium auf Agarbasis wird flüssig mit Aqua demin. angesetzt und geht nach Erhitzen in einen festen Zustand über (“Geliereffekt”). Diese Eigenschaft des verwendeten Agars, der aus einem Rotalgenextrakt gewonnen wird, macht man sich zunutze, indem das noch flüssige Medium in Petrischalen ausgegossen wird, in dem es dann beim Abkühlen als sogenannte Agarplatten aushärtet. Zusätzlich werden dem Medium Hefeextrakt als Aminosäure-, Peptid- und Vitaminquelle (hpts. Vitamin B), aus Fleischextrakt gewonnenes Pepton als Stickstoff- (aus Kreatin bzw. Kreatinin) und Kohlenstoffquelle und Glucose als Kohlenstoffquelle an Nährmitteln zugesetzt, so dass man das Medium auch als HPG-Agar bezeichnet. In noch flüssigem Zustand muss das Medium sterilisiert werden, um zu verhindern, dass sich schon vor dem Ausgiessen zu Agarplatten Mikroorganismen (z.B. Luftkeime) ansiedeln (Kontamination). Zu diesem Zweck wird die angesetzte Flüssigkeit für 20 Minuten autoklaviert. Autoklavieren ist eine in der Mikrobiologie häufig verwendete Technik zur Sterilisation, d.h. zur Erzielung von Keimfreiheit, von Arbeitsmitteln, Abfällen u.ä.. Beim Autoklavieren wird 121° C heisser und unter 2 bar Druck stehender Wasserdampf verwendet, wobei die Einwirkzeit je nach Art des abzutötendem Organismus und Umfang des zu sterilisierenden Materials 15 – 60 min beträgt. Dazu verwendet man entweder spezielle Autoklaven oder herkömmliche Dampfdruckkochtöpfe. Um den Autoklaviervorgang zu überwachen, bedient man sich verschiedener Indikationsmethoden, die auf Farbänderungen oder pH-Wert-Änderungen chemischer Reaktionen beruhen. In diesem Versuch wurden Indikatorstäbchen des Herstellers Aseptic Thermo Indicator Company (ATI) verwendet, der auf dieses Verfahren ein US-Patent hält. Bei diesem Indikatorverfahren verfärbt sich wasserfreies violettes CrCl3 unter der Wasserdampfeinwirkung zu grünem CrCl3-Hydrat, wobei sich auf dem Indikatorstäbchen die Einwirkzeit anhand der Verfärbung dreier Feldern mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber einem Kontrollfeld ablesen lässt. [1], [2]

Versuchsdurchführung:

Zur Herstellung des HPG-Agars wurden zu 150 ml Aqua demin. in einer 500 ml Laborglasflasche mit Schraubverschluss folgende Stoffe in angegebener Reihenfolge abgewogen und zugesetzt:

  • 1,3 g Hefeextrakt
  • 1,3 g Pepton
  • 0,25 g Glucose (entsprechend einer Konzentration von 0,00555 mol/l)
  • 3,75 g Agar

Nach jeder Beigabe wurde die Laborglasflasche umgeschwenkt, um die beigemischten Substanzen zu lösen, und zum Schluss wurden weitere 100 ml Aqua demin. zugesetzt, um auf 250 ml aufzufüllen. Anschliessend wurde der pH-Wert überprüft und eingestellt. Dazu wurde ein elektronischer pH-Checker verwendet. Da der erhaltene pH-Wert mit ca. 6,8 zu niedrig lag, wurde durch Zugabe von 5 Tropfen 1 molarer NaOH der gewünschte pH-Wert von 7,2 erhalten. Die Laborglasflasche wurde nun lose verschlossen (wichtig: der Deckel wurde nur lose aufgeschraubt, um einem möglichen Überdruck während des Autoklavierens eine Entweichmöglichkeit zu geben), beschriftet und mit einem Steam-Clox® Sterilisationsindikator versehen. Anschliessend wurde die Flasche für 20 min. in einem Dampfdruckkochtopf bei 121° C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurde die Laborglasflasche fest verschlossen (um eine Kontamination zu verhindern) und nach Abkühlung auf ca. 50° C zur Sterilbank verbracht. An der Sterilbank wurden 10 Petrischalen beschriftet und nebeneinander aufgestellt. Das Nährmedium wurde durch vorsichtiges (um Schaumbildung zu vermeiden) Umschwenken nochmals durchmischt und anschliessend wurde die Laborglasflasche schräg haltend aufgeschraubt. Nun wurden die Agarplatten gegossen, wobei vor jedem Ausgiessen der Nährflüssigkeit die Öffnung der Laborglasflasche kurz durch eine Bunsenbrennerflamme gezogen wurde, um evt. vorhandene Keime abzutöten. Der Deckel der zu befüllenden Petrischale wurde schräg angehoben, über die Petrischale gehalten und dann das Nährmedium so eingegossen, dass der Boden der Petrischale gut bedeckt wurde (entsprechend ca. 25 ml Nährlösung). Dann wurde der Deckel der Petrischale wieder geschlossen, beiseite gestellt und die nächste Schale gegossen. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis das Nährmedium verbraucht war. Nach ca. 15-minütiger Abkühlung der Petrischalen und Erstarrung des Agars wurden die Schalen mit dem Deckel nach unten in den Kühlschrank gestellt. Nach einer Woche wurden die Petrischalen aus dem Kühlschrank geholt und auf Kontamination und Ausbildung von Agarbrücken (erstarrter Agar zwischen Petrischalenboden und -deckel) hin untersucht.

Ergebnis:

Alle untersuchten Agarplatten waren ohne Kontamination, d.h. es war keine Koloniebildung feststellbar. Die Schichtdicke der Agarplatten war zufriedenstellend (die Petrischalen waren etwa halb hoch mit Agar bedeckt); keine der Platten wies Agarbrücken auf.

Ergebnisdiskussion:

Aufgrund des Ergebnisses kann man sagen, dass die Sterilisation mittels des Autoklavierverfahren erfolgreich war. Dies belegt auch der Sterilisationindikator (s. Abb. 1), dessen ersten beiden Kontrollfelder sich nach dem Autoklavieren nahezu vollständig verfärbt hatten. Ebenso war das Ausgiessen der Agar-Platten erfolgreich, da sich der Agar in den Petrischalen gut verteilt hat und keine Agarbrücken entstanden sind. Anzumerken ist an dieser Stelle noch, dass die Messung des pH-Wertes nach dem Anmischen der Nährlösung mit den Indikatorstäbchen einen abweichenden pH-Wert von ca. 6,5-6,8 gegenüber der Messung mit dem elektronischen pH-Meter ergab. Da bei den Indikatorstäbchen eine geringere Messgenauigkeit angenommen werden kann, wurde das Ergbnis des pH-Checkers als massgeblich verwandt. Da die Nährbodenzusammensetzung auf 1000 ml bezogen angegeben war, mussten alle Werte entsprechend auf 250 ml umgerechnet werden. Da bis auf die Angabe für Glucose alle Werte in Gramm angegeben waren, konnte man hier alle Werte durch 4 teilen, um die für 250 ml entsprechende Mengen zu erhalten (1000 ml/250 ml = 4). Für die Glucose war eine molare Konzentration von 0,00555 mol/Liter angegeben. Um eine für 250 ml Nährlösung entsprechende Menge in Gramm zu erhalten, wurde zunächst aus der chem. Summenformel der Glucose die molare Masse errechnet, diese mit der molaren Konzentration multipliziert und das Ergebnis durch 4 dividiert, da nur ein Viertel eines Liters verwendet wurde.

Rechnung:
Die molare Masse von Glucose (Summenformel C6H12O6) ergibt sich zu:
(12u * 12) + (1u * 12) + (16u * 6) = 180u entspricht 180 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,00555 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
180 g/mol * 0,00555 mol/Liter = 0,999 g/Liter
Damit erhält man für das Volumen von 250 ml mit einer molaren Konzentration von 0,00555 mol/Liter eine Masse von:
0,999 g / 4 = 0,24975 g entspricht gerundet 0,25 g

Steam-Clox© Sterilisationsindikator
Abb. 1: Steam-Clox© Sterilisationsindikator






Versuchsziel:

In diesem Versuch soll das Sterilisationsverfahren der Membranfiltration erprobt und auf seine Wirksamkeit hin überprüft werden.

Theoretische Grundlagen:

Das in diesem Versuch verwendete Verfahren der Membranfiltration beruht auf der Verwendung von Filtern deren Porendurchmesser weit unter der Grösse der zu filternden Mikroorganismen bzw. deren Sporen liegt, d.h. die zu filtrierende Flüssigkeit kann den Filter passieren, während evt. in der Lösung enthaltene Keime an der Filtermembran zurückgehalten werden. Die gängigen Membranfilter haben einen Porendurchmessern von 0,2 μm und sind in zwei Formen erhältlich: Scheibenfilter und Kerzenfilter. Scheibenfilter sind flache in ein Gehäuse eingebettete Filtermembranen unterschiedlichen Durchmessers (von 13 mm bis 293 mm) und unterschiedlichen Anschlüssen, so dass sich verschiedene Geräte wie Spritzen oder Schläuche daran anschliessen lassen; sie eignen sich besonders für kleinere Volumina. Kerzenfilter sind längliche, patronenartige Filter, die aufgrund der grösseren Filterfläche für grössere Volumina geeignet sind. Je nach zu filtrierender Flüssigkeit werden unterschiedliche Filtermaterialien verwandt; sie bestehen meist aus Mischestern des Polysaccharids Cellulose, aus Celluslosenitrat für wässrige Lösungen (hydrophile Filter) oder aus Celluloseacetat bei alkoholischen oder öligen Lösungen. Der in diesem Versuch verwendete Membranfilter des Herstellers Millipore hat einen Durchmesser von 33 mm, das Filtermaterial besteht aus hydrophilen Polyethersulfon und wird auf Spritzen angeschlossen (s. Abb. 2 und Abb. 3). Zudem wurde in diesem Versuch eine flüssige CASO-Nährlösung verwandt, ein Komplexmedium dem, ausser Glucose, ein aus Milcheiweiss proteolytisch gewonnenes Pepton (Caseinpepton) und ein aus Sojamehl proteolytisch gewonnenes Pepton (Sojamehlpepton) zugesetzt wird. Das Caseinpepton ist reich an freien Aminosäuren und das Sojamehlpepton zeichnet sich durch einen hohen Gehalt an Kohlenhydraten und Vitaminen aus. Solche Nährmedien werden zur Kultivierung anspruchsvoller Mikroorganismen verwandt. [1], [3]

Millipore Membranfilter, Deckblatt Gebrauchsanweisung Millipore Membranfilter Spezifikation
Abb. 2: Millipore Membranfilter Deckblatt Gebrauchsanweisung Abb. 3:Millipore Membranfilter Spezifikationen

Versuchsdurchführung:

Mit einer Plastikspritze wurde 1 ml einer Keimsuspension von Escherichia coli K12 aufgezogen und in ein Reagenzglas mit flüssiger CASO-Nährlösung überführt. Dabei wurde die Reagenzglasöffnung nach dem Entfernen des Wattestopfens, sowie vor dem Wiederverschliessen kurz durch die Bunsenbrennerflamme gezogen, um möglichen Kontaminationen vorzubeugen. Das Reagenzglas wurde anschliessend beschriftet und zurück in den Reagenzglasständer gestellt, um als Kontrollansatz zu fungieren. Nun wurde mit der Spritze 2 ml der Keimsuspension aufgezogen und durch einen Polyethersulfon-Membranfilter des Herstellers Millipore in ein Reagenzglas mit CASO-Nährlösung überführt. Dabei wurde, wie bei dem ersten Reagenzglas, nach Öffnen und vor dem Verschliessen die Reagenzglasöffnung im Bunsenbrenner abgeflammt. Der Membranfilter wurde so gehandhabt, das die Spritze nach Öffnen der Membranfilterverpackung auf den noch in der Herstellerverpackung verbliebenen Filter aufgesetzt wurde und auch so entnommen wurde, dass jeglicher Kontakt des Membranfilters mit anderen Gegenständen oder den Fingern vermieden wurde. Das Reagenzglas wurde beschriftet und zusammen mit dem Kontrollansatz für 24 h bei 37 °C inkubiert. Nach einer Woche wurden die Reagenzgläser auf ihre Trübung hin untersucht.

Ergebnis:

Der unfiltrierte Kontrollansatz zeigte eine deutliche Eintrübung; der filtrierte Ansatz war völlig klar und zeigte auch keinerlei Ablagerungen am Boden des Reagenzglases (Pellet).

Ergebnisdiskussion:

Die Ergebnisse zeigen, dass die Sterilisation durch die Membranfiltration erfolgreich war. Der filtrierte Ansatz war frei von Kontamination während der Kontrollansatz deutliche Anzeichen einer Vermehrung von Escherichia coli aufwies.

Die Angabe der Zusammensetzung der CASO-Lösung war auf 1000 ml und mit molaren Konzentration für Glucose, Kochsalz (NaCl) und Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) angegeben, so dass für diese Substanzen die Masse ermittelt werden musste:

Rechnung:
Für die Glucose war eine molare Konzentration von 0,0139 mol/l angegeben.
Die molare Masse von Glucose (Summenformel C6H12O6) ergibt sich zu:
(12u * 12) + (1u * 12) + (16u * 6) = 180u entspricht 180 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,0139 mol/l benötigte Masse ergibt sich zu:
180 g/mol * 0,0139 mol/l = 2,502 g/l entspricht gerundet 2,5 g

Für NaCl (Natriumchlorid, Kochsalz) war eine molare Konzentration von 0,08556 mol/l angegeben.
Die molare Masse von NaCl ergibt sich zu:
(22u * 1) + (35u * 1) = 57u entspricht 57 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,08556 mol/l benötigte Masse ergibt sich zu:
57 g/mol * 0,08556 mol/l = 4,87692 g/l entspricht gerundet 4,9 g

Für Di-Natriumhydrogenphosphat war eine molare Konzentration von 0,0176 mol/Liter angegeben.
Die molare Masse von Di-Natriumhydrogenphosphat (Summenformel Na2HPO4) ergibt sich zu:
(22u * 2) + (1u * 1) + (31u * 1) + (16u * 4) = 140u entspricht 140 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,0176 mol/l benötigte Masse ergibt sich zu:
140 g/mol * 0,0176 mol/l = 2,464 g/l entspricht gerundet 2,5 g

Gesamtbeurteilung:

Durch beide Versuche wurde die Wirksamkeit der gebräuchlichsten Sterilisationsmethoden gezeigt. Sowohl das Autoklavieren, als auch die Membranfiltration zeigten nach ihrer Anwendung keinerlei Kontamination des sterilisierten Materials. Dennoch ist sicherlich zu bedenken, dass es bei der Sterilisation keine 100 %-ige Keimabtötung geben kann, sondern man davon ausgeht, dass durchschnittlich ein Keim von einer Million überlebt. Ferner sind Keimbelastung (Art und Umfang), Volumina und Materialeigenschaften des Sterilisiergutes, sowie Eigenheiten der verwendeten Autoklaven oder Filter zu beachten, um mögliche Risiken zu minimieren, insbesondere im Umgang mit pathogenen Mikroorganismen. Es sei auch darauf hingewiesen, dass das Autoklavieren, obwohl eine der wirksamsten und weitverbreitesten Sterilisationsmethoden auch seine Nachteile mit sich bringt: So werden bestimmte Materialien nach wiederholter Autoklavierung porös oder undicht (z.B. Gummi) oder bei der Sterilisation von Nährmedien werden wichtige Zusatzstoffe durch die hohe Hitze denaturiert oder völlig zersetzt (z.B. Vitamine, Nukleinsäuren), so dass diese Materialien nicht mehr die gewünschten Eigenschaften aufweisen (z.B. Selektivnährböden) oder dadurch gar neue Kontaminationsgefahren entstehen (z.B. undichte Gummistopfen). Bei der Membranfiltration ist insbesondere darauf zu achten, dass die vorgeschriebene Durchflussmenge der Filter nicht überschritten wird bzw. der Filter nicht durch andere Zusatzstoffe verstopft und somit unwirksam wird.
Membranfiltration und Autoklavieren lassen sich auch gut miteinander kombinieren, um z.B. hitzeempfindliche Nährmedien mittels Membranfiltration zu sterilisieren und dann in autoklavierte Gefässe abzufüllen. Je nach Ziel, Art und Weise der verwendeten Methoden ist sicherlich abzuwägen, welcher Sterilsationsmethode man den Vorzug gibt, um bestmögliche Resultate zu erzielen. So sind neben dem Autoklavieren oder der Membranfiltration auch andere Sterilisationsmethoden in Gebrauch, z.B. andere Filtertechniken, Heissluftsterilisation, Sterilisation durch Gammastrahlen oder chemische Verfahren. Häufig begnügt man sich auch mit der Desinfektion, also der Keimreduzierung bzw. dem Abtöten von pathogenen Keimen, die für manche Zwecke vollkommen ausreichend sind (z.B. Raumreinigung, Händedesinfektion).

Referenzen:

[1] Bast, E. 'Mikrobiologische Methoden', 2. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag 2001
[2] SteriTec Inc., TX, USA
[3] EMD Millipore



© tom linder, b.sc.
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Letzte Aktualisierung: 03.02.24