- Gramfärbung -

In diesem Versuch soll die Gramfärbung an einer Mischkultur von Escherichia coli K12 und Bacillus subtilis durchgeführt und mikroskopisch überprüft werden.

Bei der Gramfärbung macht man sich den unterschiedlichen Aufbau der Zellwände von Bakterien zunutze, um aufgrund der Anfärbung zwischen verschiedenen Bakterienarten morphologisch differenzieren zu können. Allgemein bestehen bakterielle Zellwände aus dem Peptidoglykan Murein, einem Zucker-Polymer, dessen einzelne Polysaccharidketten über aminogene Seitenketten miteinander verknüpft sind. Die einzelnen Mureinpolymere werden extraplasmatisch synthetisiert und bilden in mehreren Schichten eine Hülle um das Bakterium aus, die auch als Mureinsacculus bezeichnet wird. Bakterien lassen sich nun anhand der Schichtdicke dieses Mureinsacculus in gram-negative, d.h. sich in der Gramfärbung nicht anfärbende Bakterien mit keinen oder wenigen Mureinschichten, und gram-positive, d.h. sich durch die Gramfärbung anfärbbare Bakterien mit einem dicken Mureinsacculus aus zahlreichen Schichten Murein, unterteilen.
Die sich aufgrund der Gramfärbung ergebende Unterscheidung in gram-negative und gram-positive Bakterien reflektiert auch eine taxonomische Unterteilung der Eubacteria (Eubakterien) in zwei grosse Gruppen. Neben einer Zellwand mit keinem oder wenig Murein weisen die gram-negativen Bakterien i.d.R. eine zweite, äussere Membran auf, die einen extrazellulären Reaktionsraum umschliesst, der als Periplasma oder periplasmatischer Raum bezeichnet wird. Eine solche zweite, äussere Membran, sowie ein periplasmatischer Raum ist bei den gram-positiven Bakterien nicht vorhanden.
Zu den gram-negativen Bakterien werden insb. die Proteobacteria (Purpurbakterien), die Terra- und Glidobactaria mit u.a. den Cyanobacteria (Cyanobakterien, Blaualgen) und einer weitere Gruppe mit u.a. den Planctobacteria und den Spirochaeta (Spirochäten) gerechnet. Zu den gram-positiven Bakterien zählen v.a. die beiden Gruppen der Actinobacteria (Actinobakterien) mit u.a. den Actinomycetes, sowie die Firmicutes mit u.a. den Bacilli und den Clostridia.
Die Technik der Gramfärbung geht auf den dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram (1853-1938) zurück und basiert auf einer sog. Differentialfärbung, bei der im ersten Schritt mittels Kristallviolett (blau-violetter Farbstoff) und Lugol'scher Lösung die Bakterien angefärbt werden. In einem zweiten Schritt wird mit Ethanol ausgewaschen und anschliessend erfolgt eine Gegenfärbung mit Safranin (roter Farbstoff). Das Kristallviolett dringt in die Zellen ein und reagiert mit den sauren Gruppen des Cytoplasmas, das durch die Lugol'sche Lösung (Kaliumiodid und Iod) hinzugegebene Iod bildet mit dem Kristallviolett Komplexe (sog. Farblack), die wasserunlöslich sind und ausfallen. Der anschliessende Waschvorgang mit 96 %-igem Ethanol löst diese Komplexe und wäscht sie aus den Zellen aus. In gram-positiven Bakterien werden diese Komplexe aufgrund des vielschichtigen Mureins zurückgehalten, während bei den gram-negativen Bakterien die Iod-Farbstoffkomplexe ausgewaschen werden. Durch die Gegenfärbung mit Safranin werden die Bakterien nochmals gefärbt, wobei die gram-positiven eine dunkel-violette Färbung annehmen und die gram-negativen Bakterien rot eingefärbt werden. Die Unterscheidung von gram-positiven und gram-negativen Bakterien hat in der Beurteilung von Krankheitserregern (pathogenen Keimen) eine besondere Bedeutung, da viele Antibiotika die Mureinsynthese hemmen und somit häufig nur gegen gram-positive Bakterien wirksam sind. ^[1]

Ein sauberer (d.h. frisch aus der Verpackung entnommener) Objektträger wurde in eine Cornetpinzette eingespannt und mehrfach kurz durch die nichtleuchtende Flamme eines Bunsenbrenners bewegt, um den Objektträger zu entfetten. Nach Abkühlen des Objektträgers wurde aus einer Bakterienmischkultur von Escherichia coli K12 und Bacillus subtilis mit einer ausgeglühten Impföse zwei Tropfen des Inokulums (Impfgut) auf die Mitte des Objektträgers aufgebracht und gut verteilt, so dass sich eine hauchdünne Schicht der Bakteriensupension auf dem Objektträger bildete. Anschliessend wurde der Objektträger an der Luft getrocknet, um den Zellen Feuchtigkeit zu entziehen, die bei der Hitzefixierung sonst dazu führen könnte, dass die Zellen aufplatzen und beschädigt werden. Nach ca. 15 minütiger Trockenzeit wurde der Suspensionsausstrich hitzefixiert. Dazu wurde der Objektträger mit der Schichtseite nach oben mit Hilfe der Cornetpinzette in einer senkrechten Kreisbewegung dreimal durch die nicht leuchtende, nicht prasselnde Flamme bewegt. Dadurch werden die protoplasmatischen Proteine koaguliert und somit das Zellmaterial an der Oberfläche des Objektträgers fixiert. Nach Abkühlung des erhitzten Objektträgers wurden über dem Waschbecken die eigentlichen Färbeschritte durchgeführt: Zunächst wurde auf den Suspensionsausstrich einige Tropfen Ammoniumoxalat-Kristallviolett-Lösung gegeben, so das der Ausstrich ganz bedeckt war. Nach 1 minütiger Einwirkzeit wurde der Farbstoff abgegossen und der Objektträger kurz (ca. 2 s) unter dem leicht laufenden Leitungswasserstrahl abgespült. Danach wurde der blaue Farbstoff durch Zugabe einiger Tropfen Lugol'scher Lösung fixiert ('Beizen'). Nach einer Einwirkzeit von einer Minute wurde die Iodlösung abgegossen und kurz (ca. 2 s) unter leicht laufendem Leitungswasserstrahl gespült. Im nachfolgenden Differenzierungsschritt wurde der Objektträger mit 96 %-igem Ethanol ausgewaschen, indem vom oberen Rand des Objektträgers das Ethanol solange zugetropft wurde, bis der abtropfende Alkohol farblos blieb, insgesamt jedoch nicht länger als 10 s, um nicht die gesamten Farbstoffkomplexe auszuwaschen (und damit auch die gram-positiven Bakterien zu entfärben). Sofort nach dem Auswaschen wurde der Objektträger für ca. 5 s unter dem Leitungswasserstrahl gespült. In der nun sich anschliessenden Gegenfärbung wurde auf den Ausstrich einige Tropfen Safranin-Lösung aufgebracht und diese für 1 Minute einwirken lassen. Nach Ablauf der Einwirkzeit wurde der Ausstrich unter dem Leitungswasserstrahl gespült, bis kein Farbstoff mehr ablief. Anschliessend wurde das fertige Präparat mit Hilfe von Filterpapierstreifen getrocknet und dann mikroskopiert.

Die Färbung verlief negativ, d.h. unter dem Mikroskop waren bei verschiedenen Vergösserungen (100-, 400- und 1000-fach) keine brauchbaren Ergebnisse zu erkennen. Bei 400-facher Vergrösserung waren andeutungsweise blau angefärbte Partikel zu erkennen, jedoch liess sich dieser Eindruck bei 1000-facher Vergrösserung im Immersionsobjektiv nicht erhärten.

Das Fehlschlagen der Gramfärbung kann verschiedene Ursachen haben: Unvollständige Lufttrocknung mit der Folge, dass die Zellen bei der Hitzefixierung beschädigt werden, zu starkes Auswaschen mit Ethanol, wobei sämtliche Farbstoffkomplexe zerstört werden oder zu langes Einbringen des Ausstriches in die Bunsenbrennerflamme, bei dem die Zellen beschädigt oder gar zerstört werden. Ein weiterer Umstand, der in diesem Versuch auffällig zutage trat, war das Verhalten der Bakteriensuspension beim Auftragen auf den entfetteten Objektträger; dabei zog sich der aufgebrachte Tropfen sehr stark zusammen, ein Hinweis darauf, dass der Objektträger u.U. nicht vollständig sauber bzw. entfettet war. Inwieweit dies den weiteren Verlauf der Färbung negativ beeinflusst hat, bleibt spekulativ. Zudem hatte sich beim Auftragen des Immersionsöls ein Teil desselben unter das Deckglas gesaugt (Kapillareffekt); da man aber normalerweise das Immersionsöl auch direkt auf das Präparat aufbringen kann, sollte dies keinen grösseren Einfluss auf das Ergebnis gehabt haben. Dennoch enstand der Eindruck, das der Direktkontakt des Immersionsöls das Präparat (durch evt. Löseerscheinungen) beschädigt hatte.
Die mikroskopische Untersuchung eines gelungenen Präparates zeigte bei 1000-facher Vergrösserung deutlich die Differenzierung der gram-negativen, rot angefärbten Escherichia coli und den gram-positiven dunkelblau/dunkelviolett angefärbten Bacillii subtilii (s. Zeichnung).

© tom linder, b.sc.
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Letzte Aktualisierung: 03.02.24