Mikrobiologisches Praktikum

- Anreicherung von Azotobacter, einem stickstofffixierenden Bakterium -



Share Button




Versuchsziel:

In diesem Versuch sollen N2-fixierende Bakterien der Art Azotobacter chroococcum in einer Kultur angereichert werden.

Theoretische Grundlagen:

Unter einer Anreicherungskultur von Mikroorganismen versteht man das Anlegen einer Kultur, in der die Anzahl (Populationsgrösse) der anzureichernden Mikroorganismen gegenüber dem natürlichen Vorkommen stark zugunsten des anzureichernden Mikroorganismus verschoben ist. Viele Mikroorganismen kommen in der Natur nur in relativ geringen Mengen (Anzahl Zellen pro Volumen- oder Gewichtseinheit des untersuchten Mediums) und in Mischpopulationen vor. Will man solche Organismen untersuchen, muss man diese zunächst anreichern, d.h. ihre Anzahl pro Volumen- oder Gewichtseinheit erhöhen und, wenn möglich, sie gegenüber ihren Konkurrenten der Mischpopulation bevorteilen, so dass schon eine teilweise Isolierung (Selektion) der anzureichernden Organismen erfolgt. Dazu bedient man sich der Technik der Anreicherungskultur, in der die zu untersuchenden Organismen unter für sie optimalen Bedingungen angezogen werden. Diese optimalen Bedingungen können u.U. selektiv auf andere Organismen wirken, d.h. deren Wachstum wird durch diese Bedingungen stark verlangsamt oder kommt völlig zum Erliegen. Einen solchen selektiven Effekt einer Anreicherungskultur kann man i.d.R. noch verstärken, indem man z.B. Substanzen zu der Anreicherungskultur hinzugibt, die dem anzureichernden Organismus nicht schaden, aber etwaige konkurrierende Arten am Wachstum hindern oder dieses stark verlangsamen (Gegenselektion). Vorraussetzung für ein solches Verfahren ist, dass man die optimalen Wachstumsbedingungen der anzureichernden Organismen kennt und idealerweise auch die Zusammensetzung der natürlichen Mischpopulation aus der die Anreicherung erfolgen soll. Aufgrund der physiologischen Vielfalt der Mikroorganismen unterscheiden sich deren Wachstumsbedingungen stark voneinander und dementsprechend variieren auch die zum Einsatz gebrachten Anreicherungsverfahren. Jedoch werden immer flüssige Nährmedien mit meist genau definierter Zusammensetzung (Synthetisches Medium) verwandt. In diesem Versuch sollen freilebende, stickstofffixierende Bakterien der Art Azotobacter chroococcum angereichert werden.
Die Bakterienart Azotobacter chroococcum kommt natürlich lebend im Boden vor, bevorzugt dort leicht alkalisches Milieu und erreicht in einer vielfältigen Mischpopulation (Bodenmilieu) eine Zellzahl von ca. 104 Zellen pro g Erde. Azotobacter chroococcum zählt zu der Gruppe der γ-Proteobakterien, ist ca. 4 μm gross, peritrich begeisselt, gram-negativ, pleomorph (d.h. kann verschiedene Formen ausbilden, tritt aber typischerweise in Form gepaarter Stäbchen auf), und ist in der Lage inerten Luftstickstoff N2 zu fixieren, der als Ammonium-Ion (NH4) zum Aufbau von weiteren Stickstoff-haltigen Verbindungen, wie z.B. Aminosäuren verwandt wird. Zu dieser Stickstofffixierung wird Azotobacter durch einen Nitrogenase-Enzymkomplex befähigt, der aus den Enzym-Komponenten Dinitrogenase und Dinitrogenase-Reduktase besteht. An dem Nitrogenase-Enzymkomplex werden unter Energieverbrauch (ATP) Wasserstoffprotonen auf den molekularen Stickstoff übertragen. Im aktiven Zentrum der Dinitrogenase ist ein Molybdän-Atom, sowie ein Eisen-Schwefel Komplex gebunden, welche diese Reaktion katalysieren. Insgesamt ist der gesamte Prozess sehr energieaufwendig, so dass die Zelle pro 1 g fixiertem N2 ca. 100 g Glucose veratmen muss. Azotobacter chroococcum ist ein obligat aerobes und chemoorganoheterotrophes, also Kohlenstoffverbindungen oxidierendes Bakterium und ist in der Lage, Mannit als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Diesen Tatbestand und die Molybdän-Abhängigkeit der Dinitrogenase macht man sich bei der Zusammensetzung der Anreicherungsnährlösung zunutze, indem mineralisches Molybdän (Na2MoO4) und nur Mannit als Kohlenstoffquelle zugesetzt wird, so das alle Organismen, die nicht in der Lage sind, diesen Nährstoff zu verwenden, schon ausselektioniert werden. Ferner bildet Azotobacter chroococcum dickwandige Cysten als Dauerstadien aus, welche mit PHB (Polyhydroxybuttersäure) angereicherten Granula versehen sind. Somit wird schon ein Grossteil der Mikroorganismen bei der Lufttrocknung der Erde, aus der man die Organismen entnimmt und anreichert, schon abgetötet, da bei der Austrocknung nur sporen- und cystenbildende Arten überleben. Als weiteres morphologisches Charakteristikum von Azotobacter chroococcum ist die Ausbildung von aus Alginat bestehenden Schleimkapseln und die Produktion und Ausscheidung von Melaninen (Allomelanine), welche als bräunliche Färbung der Kolonien in Erscheinung treten. Man vermutet, das sowohl die Schleimbildung als auch die Melaninproduktion dem Schutz des Nitrogenase-Systems vor Oxidation dient, da dieses eine sehr grosse Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff aufweist, Azotobacter jedoch aerobe Bedingungen braucht. Ein weiterer Mechanismus zum Schutz des Nitrogenase-Komplexes ist die hohe Stoffwechselrate, so dass intrazellulär keine grösseren Sauerstoffkonzentrationen auftreten können. [01], [02], [03], [04], [05], [06], [07], [08]

Versuchsdurchführung:

In der ersten Woche des Versuches wurden in einem ersten Arbeitsschritt zu 25 ml einer Anreicherungslösung in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben eine gehäufte Spatelspitze Calciumcarbonat (entspricht etwa 0,5 g), zum Zwecke der Pufferung der Lösung, sowie eine gehäufte Spatelspitze gesiebte und luftgetrocknete Gartenerde (ca. 0,5 g) hinzugegeben und durch vorsichtiges Umschwenken gut durchmischt. Anschliessend wurde der Erlenmeyerkolben beschriftet und 4 Tage bei 25 °C inkubiert. Die Anreicherungslösung hatte folgende Zusammensetzung:

Zu 1000 ml Wasser wurden hinzugegeben:

  • 1,0 ml    Spurenelementlösung mit EDTA (s. Anmerkung)
  • 1,0 g      K2HPO4
  • 0,5 g      MgSO4 x 7 H2O
  • 0,005 g  Na2MoO4 x 2 H2O
  • 10,0 g    Mannit

Der pH-Wert der Anreicherungslösung wurde mittels 1 M HCl auf 7,4 - 7,6 eingestellt.

In der zweiten Woche wurde der Erlenmeyerkolben auf das Anwachsen der Anreicherungskultur hin überprüft und mit einer ausgeglühten Impföse etwas Zellmaterial von der Kahmhaut entnommen, mikroskopiert und eine Zeichnung des Präparats angefertigt. Ein weiteres Inokulum von einer Reinkultur von Azotobacter vinelandii wurde in einem Tropfen sterilen Wassers in einem Reagenzglas suspendiert und auf eine Agarplatte mit Azotobacter-Agar im 13-Strich-Verfahren ausgestrichen. Diese Agarplatte wurde auf der Unterseite beschriftet und mit der Unterseite nach oben bei 25 °C für 2 Tage inkubiert. Der Azotobacter-Agar hatte folgende Zusammensetzung:

Zu 1000 ml Wasser wurden hinzugegeben:

  • 1,0 ml    Spurenelementlösung mit EDTA (s. Anmerkung)
  • 0,2 mol ≙ 20,0 g      CaCO3
  • 4,6 mmol ≙ 0,8 g      K2HPO4
  • 1,47 mmol ≙ 0,2 g      KH2PO4
  • 2,03 mmol ≙ 0,5 g      MgSO4 x 7 H2O
  • 0,2066 mmol ≙ 0,5 g  Na2MoO4 x 2 H2O
  • 0,036 mmol ≙ 0,01 g      FeSO4 x 7 H2O
  • 0,111 mol ≙ 20,0 g    Glucose
  • 20,0 g      Agar

Der Azotobacter-Agar hat die Konsistenz eines normalen Agars, ist jedoch von undurchsichtig, milchig-weisser Farbe.

In der dritten Woche wurde der Ausstrich von Azotobacter vinelandii aus der zweiten Woche morphologisch charakterisiert, ein Inokulum mittels Impföse entnommen, suspendiert und ein Inokulum dieser Suspension mikroskopiert. Hierbei wurde das Präparat mit Tusche angefärbt, indem eine kleiner Tropfen Tusche neben dem Deckglas aufgebracht wurde und dieser mittels eines auf der anderen Seite des Deckglases angelegten Filterpapierstreifens durch die Wasserschicht zwischen Deckglas und Objektträger gesaugt wurde.

Ergebnis:

Aufgrund der deutlichen Ausbildung einer schleimigen Kahmhaut in dem Erlenmeyerkolben ('Kultur in flacher Schicht') kann man sagen, dass die Anreicherung von Azotobacter chroococcum erfolgreich war. Dies belegt auch die mikroskopische Untersuchung, in der deutlich die charakteristischen Strukturen der gepaarten Stäbchen, die stark lichtbrechenden, PHB (Polyhydroxybuttersäure) enthaltenden Granula, sowie die Schleimkapseln, die mikroskopisch als eine Art Hofbildung um die gepaarten Bakterien in Erscheinung treten, erkennbar waren. Ebenso erfolgreich verlief die Anlage einer Reinkultur von Azotobacter vinelandii aus dem zweiten Versuchsteil (2. Woche), da sowohl bei dem makroskopischen Befund der gebildeten Kolonien, wie auch bei der mikroskopischen Untersuchung eines davon entnommenen Inokulums eine grosse Homogenität feststellbar war. D.h. alle gebildeten Kolonien waren in der Kultur sehr gleichartig und entsprachen der typischen Charakterisierung von Azotobacter. Unter dem Mikroskop waren alle beobachteten Zellen von augenscheinlich gleichem Typ und entsprachen den charakteristischen "Doppelstäbchen" mit einer Schleimkapsel der Azotobacter-Gattung. Die Ergebnisse der makroskopischen, morphologischen Charakterisierung von Azotobacter vinelandii sind in der folgenden Tabelle dargestellt:

Tab. 2: Koloniemorphologie der Azotobacter vinelandii Kultur
 FarbeDurchmesserFormRandProfilOberflächeKonsistenzNährbodenverfärbung
Azotobacter vinelandiicreme-beige1-2 mmrundglattkonvexglatt, glänzendschleimigstark gelbe Verfärbung des weissen Agars,
insbesondere bei älteren Kolonien

Ergebnisdiskussion:

Die Angabe für die Zusammensetzung des Azotobacter-Agars war auf 1000 ml Wasser (ad, d.h. zu 1000 ml Wasser hinzu) bezogen in molaren bzw. millimolaren Konzentrationen angegeben, so dass die Massen für die entsprechenden Substanzen berechnet werden mussten.

Rechnung:
Für Calciumcarbonat (CaCO3) war eine molare Konzentration von 0,2 mol/Liter angegeben.
Die molare Masse von CaCO3 ergibt sich zu:
(40u * 1) + (12u * 1) + (16u * 3) = 100u entspricht 100 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,2 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
100 g/mol * 0,2 mol/Liter = 20 g/Liter

Für Di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) war eine molare Konzentration von 4,6 mmol/Liter (≙ 0,0046 mol/Liter) angegeben.
Die molare Masse von K2HPO4 ergibt sich zu:
(39u * 2) + (1u * 1) + (31u * 1) + (16u * 4) = 174u entspricht 174 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,0046 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
174 g/mol * 0,0046 mol/Liter = 0,8004 g/Liter entspricht gerundet 0,8 g

Für Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 war eine molare Konzentration von 1,47 mmol/Liter (≙ 0,00147 mol/Liter) angegeben.
Die molare Masse von KH2PO4 ergibt sich zu:
(39u * 1) + (1u * 2) + (31u * 1) + (16u * 4) = 136u entspricht 136 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,00147 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
136 g/mol * 0,00147 mol/Liter = 0,19992 g/Liter entspricht gerundet 0,2 g

Für hydratisiertes Magnesiumsulfat (MgSO4 x 7 H2O) war eine molare Konzentration von 2,03 mmol/Liter (≙ 0,00203 mol/Liter) angegeben.
Die molare Masse von MgSO4 x 7 H2O ergibt sich zu:
(24,3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) + (7 * ((1u * 2) + (16u * 1))) = 246,3u entspricht 246,3 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,00203 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
246,3 g/mol * 0,00203 mol/Liter = 0,499989 g/Liter entspricht gerundet 0,5 g

Für hydratisiertes Di-Natriummolybdäntetroxid (Na2MoO4 x 2 H2O) war eine molare Konzentration von 0,2066 mmol/Liter (≙ 0,002066 mol/Liter) angegeben.
Die molare Masse von Na2MoO4 x 2 H2O ergibt sich zu:
(23u * 2) + (96u * 1) + (16u * 4) + (2 * ((1u * 2) + (16u * 1))) = 242u entspricht 242 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,002066 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
242 g/mol * 0,002066 mol/Liter = 0,499972 g/Liter entspricht gerundet 0,5 g

Für hydratisiertes Eisensulfat (FeSO4 x 7 H2O) war eine molare Konzentration von 0,036 mmol/Liter (≙ 0,000036 mol/Liter) angegeben.
Die molare Masse von FeSO4 x 7 H2O ergibt sich zu:
(56u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) + (7 * ((1u * 2) + (16u * 1))) = 278u entspricht 278 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,000036 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
278 g/mol * 0,000036 mol/Liter = 0,010008 g/Liter entspricht gerundet 0,01 g

Die molare Masse von Glucose (Summenformel C6H12O6) ergibt sich zu:
(12u * 12) + (1u * 12) + (16u * 6) = 180u entspricht 180 g/mol
Die für die molare Konzentration von 0,111 mol/Liter benötigte Masse ergibt sich zu:
180 g/mol * 0,111 mol/Liter = 19,98 g/Liter entspricht gerundet 20,0 g

Anzumerken ist, dass in Abweichung von der Versuchsvorschrift nur Azotobacter vinelandii als Reinkultur übertragen wurde und die Gewinnung einer Reinkultur von Azotobacter chroococcum aus der Anreicherungskultur aus Zeitmangel unterblieb. Azotobacter vinelandii produziert nicht so viel Schleim, wie Azotobacter chroococcum und sondert darüberhinaus einen charakteristischen, fluoreszierenden Farbstoff ab.

Anmerkung:

Zum Zeitpunkt des Praktikums war die exakte Zusammensetzung der Spurenelementlösung nicht bekannt.
Solche Spurenelementlösungen sind als gebrauchsfertige Lösungen kommerziell erhältlich oder lassen sich als Stammlösungen im Labor ansetzen.
Beispiele für Rezepturen von Spurenelementlösungen unterschiedlicher Zusammensetzung finden sich bspw. im Methodenskript der AG Cypionka an der Universität Oldenburg [11] oder bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSZM).
Exemplarisch für die verschiedenen Lösungen der AG Cypionka, die auf einer Publikation von Tschech und Pfennig (1984) [12] basieren, wird untenstehend die Zusammensetzung der Spurenelementlösung SL 11 und für die Spurenelementlösungen des DSZM die des Mediums 141 [13] angegeben. Die Rezepturen der beiden hier angegebenen Lösungen unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung v.a. anhand des anionischen Anteils der verwendeten Salze, so dass man die vom pH-Wert abhängige Dissoziation und Löslichkeit dieser Stoffe beachten sollte. Zudem werden verschiedene Komplexbildner verwendet (EDTA bei der SL11 Lösung, NTA bei der Lösung des DSZM) und erstere Lösung (SL11) enthält ein Molybdänsalz anstatt eines Kalium-Aluminium-Komplexes (DSZM). Anhand dieser Unterschiede wird deutlich, was bei der Auswahl der Zusammensetzung von Spurenelementlösungen zu berücksichtigen ist: Häufig sind bei den verschiedenen Bakteriengattungen oder -arten Enzyme vorhanden, die spezielle Metallionen als Co-Faktoren benötigen (wie z.B. das Molybdän-Ion der Nitrogenase von Azotobacter sp.; s.a. Mikroelemente). Diese Elemente sollten natürlich in einem Anreicherungsmedium für die betreffenden Bakterien vorhanden sein. Ferner kann die Bildung oder Anwesenheit bestimmter Stoffe bzw. Ionen, wie z.B. Carbonat CO32+, Hydroxid OH- oder Sulfid in Form von H2S die Bioverfügbarkeit der Spurenlemente stark beeinträchtigen, da die Metallkationen der Spurenelemente ausgefällt werden und dann nicht mehr in der Lösung zur Verfügung stehen. Diesem Verhalten soll die Adjustierung des pH-Wertes und v.a. die Zugabe von Komplexbildnern, insb. von EDTA, in mindestens äquimolarer Menge zu den zu komplexierenden Metallionen entgegenwirken. Bei den Komplexbildnern ist jedoch zu beachten, dass Schwermetall- (z.B. Hg2+) und andere Metallionen tlw. in der Lage sind, die Metallionen der Spurenelemente aus den EDTA-Komplexen zu verdrängen und so ebenfalls deren Bioverfügbarkeit herabsetzen (s.a. Patentschrift des Europäischen Patents EP2231528 [14]).

Spurenelementlösung SL11:
ad 1000,0 ml destilliertes Wasser
5,2 g EDTA-Dinatriumsalz
1,5 g FeCl2 x 4 H2O
190,0 mg CoCl2 x 6 H2O
100,0 mg MnCl2 x 2 H2O
70,0 mg ZnCl2
36,0 mg Na2MoO4 x 2 H2O
24,0 mg NiCl2 x 6 H2O
6,0 mg H3BO3
2,0 mg CuCl2 x 2 H2O

Vor dem Auffüllen mit dem Aqua dest. auf pH 6 einstellen.


Spurenelementlösung (DSZM):
ad 1000,0 ml destilliertes Wasser
1,5 g Nitrilotriessigsäure (NTA)
3,0 g MgSO4 x 7 H2O
1,0 g NaCl
500 mg MnSO4 x H2O
180 mg CoSO4 x 7 H2O
180 mg ZnSO4 x 7 H2O
100 mg FeSO4 x 7 H2O
100 mg CaCl2 x 2 H2O
20 mg KAl(SO4)2 x 12 H2O
10 mg CuSO4 x 5 H2O
10 mg H3BO3

Zunächst das NTA auflösen und den pH mit KOH auf 6,5 einstellen.
Danach Zugabe der Mineralsalze und schliesslich den pH mit KOH auf 7,0 adjustieren.

Referenzen und weiterführende Informationen:

[01] Bast, E. 'Mikrobiologische Methoden', 2. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag 2001
[02] Azotobacter, MicrobeWiki, Kenyon College, Gambier, OH, USA
[03] Azotobacter, Wikipedia DE
[04] Marco d'Ischia, Kazumasa Wakamatsu, Alessandra Napolitano, Stefania Briganti,José-Carlos Garcia-Borron, Daniela Kovacs, Paul Meredith, Alessandro Pezzella, Mauro Picardo, Tadeusz Sarna, John D. Simon, Shosuke Ito (2013) 'Melanins and melanogenesis: methods, standards, protocols', Pigment Cell and Melanoma 26(5), 616-633; DOI: 10.1111/pcmr.12121
[05] Azotobacter genomes, Integrated Microbial Genomes (IMG), einem Projekt des Department of Energy of the United States (DoE) und des Joint Genome Institute (JGI), Walnut Creek, CA, USA
[06] Shivprasad, S., Page, W. J. (1989) 'Catechol Formation and Melanization by Na+-Dependent Azotobacter chroococcum: a Protective Mechanism for Aeroadaptation ?', Appl. Environ. Microbiol., 55(7), 1811-1817; DOI: 10.1128/aem.55.7.1811-1817.1989
[07] Plonka, P. M., Grabacka, M. (2006) 'Melanin synthesis in microorganisms - biotechnological and medical aspects.', Acta Biochimica Polonica, 53(3), 429-443; DOI: 10.18388/abp.2006_3314
[08] Tschech, A., Pfennig, N. (1984) 'Growth yield increase linked to caffeate reduction in Acetobacterium woodii.', Arch. Microbiol., 137(2), 163-167, DOI: 10.1007/BF00414460
[09] Medium 141 Adobe PDF, Leibniz Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
[10] Trace element solution for biogas methods, Patentschrift des Patents EP2231528 am Europäischen Patentamt



© tom linder, b.sc.
Übersicht Protokolle
Impressum
Letzte Aktualisierung: 02.02.24