- Isolation von Purpurbakterien -

In diesem Versuch sollen Purpurbakterien aus Teichwasser isoliert und deren Keimzahl bestimmt werden.

Marine Gewässer und Binnengewässer bilden den natürlichen Lebensraum der anoxygenen, phototrophen Bakterien. Man unterscheidet aufgrund unterschiedlicher Stoffwechseltätigkeit zwischen den grünen Schwefel- und Nicht-Schwefelbakterien, sowie den Schwefel- und Nicht-Schwefelpurpurbakterien. Da diese Bakterien eine Photosynthese ohne Sauerstofffreisetzung betreiben, benötigen sie einen externen Elektronendonator für die Lichtreaktion der Photosynthese. Bei grünen Pflanzen und Cyanobakterien wird Wasser gespalten (Photolyse) und liefert damit die Elektronen für die Bildung von Reduktionsäquivalenten einerseits und andererseits wird Sauerstoff freigesetzt. Bei anoxygenen photorophen Bakterien wird diese Rolle des Wassers von anderen Verbindungen übernommen; dies kann bei photolithotrophen Arten Wasserstoff, Schwefelwasserstoff, Schwefel, Thiosulfat oder Eisen sein, bei photoorganotrophen Arten sind dies organische Verbindungen, wie z.B. Gärprodukte oder aromatische Verbindungen. Die Unterteilung der anoxygenen Bakterien in "Schwefler" und "Nicht-Schwefler" rührt nun daher, dass einige Arten, die schwefelhaltige Verbindungen als Elektronendonator verwenden, den elementaren Schwefel als Reservestoff einlagern; solche Arten werden zu den grünen Schwefelbakterien oder den Schwefelpurpurbakterien gerechnet, während andere Arten bevorzugt organische Verbindungen oder gar Wasserstoff als Elektronendonatoren verwenden. Diese Arten werden zu den grünen Nicht-Schwefelbakterien oder den Nicht-Schwefelpurpurbakterien gezählt. Taxonomisch gehören die Nicht-Schwefelpurpurbakterien zu den α- oder β-Proteobakterien, die Schwefelbakterien zu den γ-Proteobakterien und die grünen Nicht-Schwefel- und Schwefelbakterien bilden eigenständige Gruppen. Die "Schwefler" kommen meist streng geschichtet dort vor, wo hohe H₂S-Konzentration und ausreichende Lichtintensität vorherrscht; dies geht überwiegend einher mit der Tätigkeit von Sulfat reduzierenden Bakterien, die Schwefelwasserstoff als Endprodukt ihrer Stoffwechseltätigkeit bilden. Die schwefelfreien Purpurbakterien finden sich dagegen nahezu in allen oxischen und anoxischen Bereichen der Gewässer und auch im Boden. Sie sind in bezug auf ihre Kohlenstoffquelle häufig mixotroph, d.h. der Kohlenstoff kann, je nach Umweltbedingungen, aus Kohlendioxid, fixiert im Calvin-Cyclus, oder aus organischen Verbindungen stammen. Ferner sind viele Arten der schwefelfreien Purpurbakterien sehr vielseitig in ihren Stoffwechselwegen, d.h. sie können teilweise Photosynthese, aerobe Atmung und Gärung betreiben. Der Photosyntheseapparat dieser Bakterien besteht aus dem Photosystem II Komplex mit Bakteriochlorophyll a und b und den Light-Harvesting-Komplexen I und II (Lichtsammelantennen). Letztere verleihen den schwefelfreien Purpurbakterien auch ihre charakteristischen Färbungen von Rot-, Violett- und Braun-Tönen durch die akzessorischen Pigmente (Carotinoide), seltener sind auch grüne Bakterien anzutreffen. Da diese Bakterien unter natürlichen Bedingungen nur in sehr geringen Konzentrationen vorkommen (unter 100 Zellen/ml) müssen sie in diesem Versuch zunächst mittels einer Vakuumfiltrationsanlage (s. Abb. 1) isoliert und anschliessend in einem Medium mit Äpfelsäure vermehrt werden. ^[1], ^[2]

Abb. 1: Vakuumfiltrationsanlage

Für die Durchführung der Vakuummembranfiltration wurde ein frischer Nitrocellulose-Membranfilter (s. Abb. 2) des Herstellers Sartorius mit einer sterilen Pinzette aus der Verpackung entnommen und mit dem Gitternetzaufdruck nach oben auf das Unterteil des Filtrationsgeräts aufgelegt. Nun wurde der Aufsatz auf das Filtrationsgerät aufgesetzt, verschlossen (s. Abb. 3), der Absperrhahn geschlossen (waagerechte Stellung des Hahnes) und 20 ml Pepton-Salz-Lösung als Vorlage, damit keine Anhaftung der Probe stattfinden konnte, in den Aufsatz pipettiert. Anschliessend wurde 1 ml einer Teichwasser-Probe in den Aufsatz pipettiert und der Inhalt des Aufsatzes durch leichtes Umschwenken der Saugflasche durchmischt. Nun wurde die Vakuumpumpe eingeschaltet und der Absperrhahn geöffnet (senkrechte Hebelstellung), so dass der Filtrationsvorgang anlief. Es wurde solange filtriert, bis keine Flüssigkeit mehr aus dem Auslaufrohr auslief, dann wurde, nach etwa 10 s, der Absperrhahn geschlossen und die Vakuumpumpe ausgeschaltet. Der Filtrationsaufsatz wurde entriegelt, abgenommen und der nun freiliegende Membranfilter mit einer sterilen Pinzette vorsichtig am äussersten Rand gefasst, von dem Filteraufsatz abgenommen und mit den Gitternetzlinien nach oben auf den bereitstehenden Nähragar (Zusammensetzung s.u.) aufgesetzt und angedrückt, so dass keine Luftblasen zwischen Filter und Nährmedium entstanden. Die Agarplatte wurde nun im Anaerobentopf bei Licht 14 Tage bei 27 °C inkubiert.
Nach erfolgter Bebrütung wurde die Morphologie, der auf dem Membranfilter gewachsenen Kolonien, makroskopisch und mikroskopisch charakterisiert und eine Bestimmung anhand von Vergleichsmerkmalen vorgenommen. Ferner wurden die Kolonien ausgezählt.

• 10,0 g Agar
• 1,0 g DL-Äpfelsäure
• 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄)
• 0,4 g Natriumchlorid (NaCl)
• 0,4 g Ammoniumchlorid (NH₄Cl)
• 0,2 g Magnesiumsulfat-Hydrat (MgSO₄ x 7 H₂O)
• 0,2 g Hefeextrakt
• 0,05 g Calciumdichlorid-Hydrat (CaCl₂ x 2 H₂O)
• 0,01 mg Cyanocobalmin (Vitamin B12)
• 1,0 ml Spurenelementlsg. ohne EDTA (s.a. Anmerkung im Protokoll F des Mikrobiologischen Praktikums)
• 1,5 g Natriumammoniumhydrogenphophat-Hydrat (NaNH₄HPO₄ x 4 H₂O)

Abb. 2: Sartorius Membranfilter [3]	Abb. 3: Filteraufsatz

Exemplarisch wurden 4 der gebildeten Kolonien morphologisch charakterisiert und mikroskopiert.
Die Ergebnisse der Charakterisierung der Koloniemorphologie ist in der folgenden Tabelle dargestellt:

Abbildung 4 zeigt den bewachsenen Membranfilter mit den unterschiedlichen Kolonien der Purpurbakterien.

Abb. 4: Purpurbakterienkolonien

Die mikroskopische Untersuchung ergab nur für die Kolonien I und IV eindeutige Ergebnisse:
Hier zeigten sich bei der Kolonie I längliche Zellen, die monopolar, monotrich begeisselt waren und bei der Kolonie IV runde bis zitronenförmige Zellen.

Die Kolonieauszählung ergab 43 Kolonien, die sich auf dem Membranfilter gebildet hatten. Da nur eine Platte mit einer unverdünnten Probe von 1 ml untersucht wurde, ergibt sich daraus direkt die Lebendzellzahl von ~ 43000 KbE pro Liter Teichwasser.

Anhand des Bestimmungsschlüssels konnte folgende Zuordnung der untersuchten Kolonien zu den Bakterienarten getroffen werden:
Kolonie I: Blastochloris viridis
Kolonie II: Rubrivax gelatinosus
Kolonie III: Rhodopseudomonas palustris
Kolonie IV: Rhodomicrobium vanniellii

Die Anreicherung und Inkubation der Purpurbakterien ist erfolgreich verlaufen. Schwierigkeiten ergaben sich bei der mikroskopischen Auswertung, da das mikroskopische Bild bei zweien der untersuchten Kolonien keine brauchbaren, d.h. eindeutigen, Ergebnisse lieferte. Hier hätte man mit besseren, d.h. höher verdünnten, Präparaten arbeiten müssen, um auch einzelne Zellen anstatt unförmige Zellhaufen mit wenigen Details zu beobachten. Mit Skepsis ist auch die Artenbestimmung zu betrachten, da sicherlich weitergehende Untersuchungen gemacht werden müssen, um eine genaue Artenbestimmung zu gewährleisten.

© tom linder, b.sc.
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Letzte Aktualisierung: 02.02.24